2.1.2. MATERIAL Y EQUIPO DE LABORATORIO

- 2 mecheros

- 1 agitador

- 1 matraz de 500 mL

- 1 balanza

- 1 probeta de 250 mL

- 10 cajas de Petri estériles desechables

- Masking tape

- Papel aluminio

- Plumón indeleble

- Trapo

- Reactivos para el medio de cultivo

(Pedir el material marcado con

EQUIPO

- Autoclave

2.1.2.2 EQUIPO DE LABORATORIO

AUTOCLAVE: Una autoclave es un recipiente metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que permite trabajar a alta presión para realizar una reacción industrial, una cocción o una esterilización con vapor de agua. Su construcción debe ser tal que resista la presión y temperatura desarrollada en su interior. La presión elevada permite que el agua alcance temperaturas superiores a su punto de ebullición. La acción conjunta de la temperatura y el vapor produce la coagulación de las proteínas de los microorganismos, entre ellas las esenciales para la vida y la reproducción de éstos, cosa que lleva a su destrucción

Las autoclaves funcionan permitiendo la entrada o generación de vapor de agua pero restringiendo su salida, hasta obtener una presión interna de 103 kPa, lo cual provoca que el vapor alcance una temperatura de 121 grados centígrados. Un tiempo típico de esterilización a esta temperatura y presión es de 15-20 minutos. Las autoclaves más modernas permiten realizar procesos a mayores temperaturas y presiones, con ciclos estándar a 134 °C a 200 kPa durante 5 min para esterilizar material metálico; incluso llegan a realizar ciclos de vacío para acelerar el secado del material esterilizado.

2.1.3 GENERALIDADES DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS

2.1.3.1 DEFINICION DE MEDIOS DE CULTIVOS

Un medio de cultivo consta de un gel o una solución que cuenta con los nutrientes necesarios para permitir, en condiciones favorables de pH y temperatura, el crecimiento de virus, microorganismos, células, tejidos vegetales o incluso pequeñas plantas. Según lo que se quiera hacer crecer, el medio requerirá unas u otras condiciones. Generalmente se presentan desecados en forma de polvo fino o granular antes de ser preparados; ya preparados pueden encontrarse en estado sólido, semisólido o líquido. El objetivo último del cultivo es variado: antibiograma, identificación, multiplicación...

Los virus, por ejemplo, son obligados parásitos intracelulares, por lo que necesitan un medio que contenga células vivas

2.1.3.2 TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVOS

Los medios de cultivo pueden clasificarse según diferentes criterios, pero los más importantes son aquellos que se basan en:

a) Su consistencia

b) Su utilización

c) Su composición

d) Su origen

SEGÚN SU ESTADO FÍSICO (CONSISTENCIA).

1) Medios líquidos: Son los que se presentan en este estado, denominándose por esta razón caldos. El medio líquido más utilizado es el llamado caldo nutritivo, compuesto principalmente de extracto de carne, peptona y agua. Se utiliza fundamentalmente cuando se pretende la obtención de una suspensión bacteriana de una determinada concentración.

2) Medios sólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregándoles un agente gelificante. Los más utilizados son la gelatina y el agar. Gelatina: Es una proteína animal obtenida de los huesos. Tiene el inconveniente de que es hidrolizada por muchas bacterias, y además su uso está muy limitado porque su punto de fusión es bajo (licúa a temperatura ambiente) razón por la que no puede utilizarse para cultivos a 37ºC, que es la tempera óptima de crecimiento para muchos microorganismos.

3) Medios semisólidos: Se preparan a partir de los medios líquidos, agregando a éstos un agente solidificante en una proporción menor que para preparar medios sólidos. Uno de sus usos es la investigación de la movilidad de las bacterias

SEGÚN SU UTILIZACIÓN.

1) Medios comunes: Son aquellos que poseen los componentes mínimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio más conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar común, que resulta de la adición de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.

2) Medios de enriquecimiento: Son aquellos que, además de las sustancias nutritivas normales, incorporan una serie de factores indispensables para el crecimiento de microorganismos exigentes. Este enriquecimiento se hace por adición de sangre u otros productos biológicos (sangre, suero, leche, huevo, bilis, etc.) que aportan dichos factores.

3) Medios selectivos: Son medios utilizados para favorecer el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar nutricionalmente el crecimiento de una población microbiana específica. Un ejemplo de medio selectivo es el caldo selenito, que se utiliza para favorecer el crecimiento de salmonellas y frenar el del resto de enterobacterias.

4) Medios inhibidores: Cuando las sustancias añadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una población microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podrían considerarse como una variante más restrictiva de los medios selectivos.

 

5) Medios diferenciales: Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a diferenciar géneros o especies. La adición de un azúcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los gérmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. También lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.

6) Medios de identificación: Son los destinados a comprobar alguna cualidad específica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato específico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado.

 

7) Medios de multiplicación: Sirven para obtener una gran cantidad de células a partir de un microorganismo ya aislado. Seemplean en la obtención de vacunas, en la investigación y en la industria. Los medios más adecuados para la multiplicación suelen ser líquidos. El caldo-infusión cerebro-corazón (BHI), es un ejemplo típico de estos medios.

8) Medios de conservación: Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en elLaboratorio de Microbiología. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas:

a) haciendo pases periódicos de placa a placa,

b) mediante liofilización de una suspensión bacteriana, y

c) congelando las cepas en leche descremada estéril al 0,1%.

9) Medios de transporte: Se usan para el transporte de muestras clínicas que no pueden sembrarse inmediatamente. Suutilización debe hacerse introduciendo la torunda con la que se obtuvo la muestra en el interior delmedio (generalmente en un tubo). Son ejemplos típicos de este grupo los medios de Stuart-Amies,Cary-Blair, etc.

ATENDIENDO A SU COMPOSICIÓN.

Según las sustancias que entren a formar parte en su composición, los medios de cultivo pueden ser clasificados en:

1) Medios complejos: Fueron los primeros utilizados, y los más empleados se preparan a partir de tejidos animales, y más raramente de vegetales. Su composición no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podrá ser exacta. En la práctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los más empleados.

2) Medios sintéticos: Son aquellos que contienen en su composición exclusivamente sustancias químicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composición perfectamente definida.

3) Medios semisintéticos: El gran número de factores de crecimiento exigidos para ciertos gérmenes hace que la fabricación de un medio sintético para estos gérmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgánico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos gérmenes no crecen en ningún medio por muy enriquecido que esté éste, haciéndolo exclusivamente en células vivas con unas características determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc.

Según su origen:

a) NATURALES: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.
b) SINTÉTICOS: son los medios que contienen una composición química definida cualitativo y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
c) SEMISINTÉTICOS son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.

-          Fuente de energia,  puede ser:

                                                       - luz: energía luminosa que se convierte en energía química. Los microorganismos que utilizan esta fuente de energía se denominan fototrofos.

                                                  -  reacciones de oxido-reducción a partir de compuestos químicos inorgánicos u orgánicos. Los microorganismos que utilizan esta fuente de energía se denominan quimiotrofos.

 

Todos los organismos requieren una fuente de energía para obtener ATP y generar poder reductor (NADH, NADPH) por alguno de los siguientes metabolismos:

-          respiración aerobia: aceptor final de electrones O₂

-          respiración anaerobia: aceptores finales de electrones: NO₃^-, SO₄⁼, CO₂, fumarato

-          fermentación: conjunto de reacciones donde compuestos orgánicos sirven como donadores y receptores de electrones. Se produce ATP por fosforilación a nivel de sustrato.

-          Fotosíntesis

 

2.1.4.2 COMPUESTOS ORGANICOS

 

-          Fuente de carbono,  puede ser:

                                                       - CO₂: los microorganismos que utilizan esta fuente de carbono se denominan autotrofos.

                                                  -   compuestos orgánicos carbonados (azúcares, aminoácidos, ácidos grasos, etc). Los microorganismos que utilizan estas fuentes de carbono se denominan heterotrofos.

 

De la combinación de estas categorías surge la sig. clasificación de microorganismos:

 

Fuente de energía                        Fuente de carbono                         Categoría                  Ejemplos

                                           

 

Luz                                      CO₂                                        Fotoautotrofos                     Algas,

                                                                                                                      cianobacterias          

 

                                            acetato                                              Fotoheterotrofos      Alg. bacterias

                                                                          

 

 

Reacciones                                   CO₂                                        Quimiolitotrofos       Bacterias oxidantes de

de óxido-reducción                                                                                                        H₂, del azufre, de Fe²⁺                                       

                                            compuestos orgánicos                  Quimioorganotrofos           Hongos,  bacterias

Fotoautotrofos = fotolitotrofos

Fotoheterotrofos = fotoorganotrofos

2.1.4.3. MATERIALES INERTES Y GELIFICANTES

 

2.1.4.3. MATERIALES INERTES Y GELIFICANTES

Actualmente existe una serie de compuestos que consiguen gelificar o espesar una solución acuosa. Tradicionalmente estos compuestos se han utilizado en la industria alimentaria como gelificantes o espesantes, así como en las industrias químicas y farmacéuticas. También se han utilizado comúnmente en cultivos “in vitro” y como medio microbiológico.

Agar. Es un término usado para designar polisacáridos gelificantes que se dan de forma natural en ciertas algas marinas (especies Gelidium, Gracilaria y Pterocladia). Se ha utilizado en los medios de cultivo microbiológicos y de tejidos aunque tiene otras aplicaciones en el ámbito de la medicina y la alimentación.

El Agar Nutritivo es utilizado para el cultivo de una amplia variedad de microorganismos.

A principios de 1900 la APHA (American PublicHealthAssociation) sugirió esta formulación como un medio de cultivo estándar para el análisis de agua. El Agar Nutritivo se encuentra descrito en los Métodos

Estándar de la APHA y de la AOAC (Association of Oficial AnalyticalChemists) para el análisis de agua, leche y sus derivados, alimentos y otros materiales.

El Agar Nutritivo sigue siendo un medio ampliamente utilizado para el cultivo de microorganismos no fastidiosos.

En este medio el extracto de carne y la peptona aportan la fuente de nitrógeno, vitaminas y carbono. El agar es adicionado como agente solidificante.

Peptona de Gelatina 5.0

Extracto de Carne 3.0

Agar Bacteriológico 15.0

pH 6.8 ± 0.2

 

Método:

Suspender 23 g del medio en un litro de agua purificada. Calentar con agitación suave hasta su completa disolución y hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121°C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Dejar enfriar a una temperatura entre 45-50°C y vaciar en placas de Petri estériles.

 

Procedimiento:

1. Inocular las placas con una asada y sembrar por el método de estría.

2. Incubar las placas a 35° C durante 18 a 24 horas.

 

 

Almidones. Los almidones procedentes de cebada, maíz, patata, arroz, trigo y tapioca han sido utilizados como agentes gelificantes solos o en combinación con otros en cultivos “in vitro” (Zimmerman et al. 1995).

 

Isubgol. Es la cáscara mucilaginosa derivada de semillas de

PlantagoovataL. Es un polisacárido compuesto de xilosa, arabinosa y ácido galacturónico empleado en medios de cultivo “in vitro” como sustitutivo del Agar.

 

Alginatos. El ácido algínico se obtiene a partir de diferentes tipos de algas (Macrocrystis, Fucus, Laminaria, etc.) y son ampliamente utilizados en alimentación y para el cultivo de protoplastos vegetales (Pierik. 1990).

2.1.4.4 complejos organicos

2.1.4.4 COMPLEJOS ORGÁNICOS

 

Cloruro de 1-butil-3-metilimidazolio Compuesto orgánico 8 8-hidroxiquinoleína A Ácido graso cis Ácido graso trans Alquitrán Amarillo crepúsculo B Bencidina Benzoína Betaína C Capsaicina Carbonato de glicerol Citrato de aluminio Citrato de calcio Citrato de plata Citrato de plomo Cloroxilenol Compuestos orgánicos volátiles Creatinina Cresol Cristal violeta

D DEET Dendrímero Diazometano Dietilftalato Dioxina DNOP F Fosfato de lactoflavina Furazolidona G Glifosato H Hapteno Helenalina Heptazina Hexafluoro-2-propanol Hexametilentetramina Hidrato de metano Holoturina I Integrina Isoaloxazina Isocianato Isopropil tioxantona L

M (cont.) Melanoidina Meso-xilitol Muscona N N,N-dimetilformamida Neral O Organohalógeno Oxalato (química) P Petricor Piretroide S Safrol Sales biliares Salicilato de metilo Sildenafilo Steviol Sucralosa Sulfato de dehidroepiandrosterona Sulfonato de alquilbenceno lineal T Tartracina Tensoactivo

 

2. 1. 5. PREPARACIÓN Y MANEJO DE SOLUCIONES STOCK

PREPARACION DE SOLUCIONES STOCK PARA EL MEDIO MS.

Métodos los cuales se mencionan posteriormente estos se indican en la parte de abajo, se utilizan para la preparación de las 4 soluciones que componen al medio de cultivo para la propagación de plantas in vitro es por ello que al momento de querer preparar dicha solución se deben de hacer cálculos dependiendo la cantidad de plantas que se deseen cultivar, de acuerdo a esto mediante los cálculos ya que por medio de estos se indicara cuanto se pesara de cada componente del MS; con el fin de poder obtener un buen manejo y por lo tanto esto permite que se tenga una buena propagación.

Preparación de una solución stock de macronutrientes MS x10 (solución 1)

Por ejemplo para obtener un litro de dicha solución llénese un erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añádase cada uno de sus componentes (Tabla 1) disolviéndolo totalmente antes de añadir para evitar que se hagan grumos y sobre todo para que la solución este bien concentrada en la siguiente tabla se representan las sustancias y el peso en gramos que se le agregara para la preparación de 500ml por lo consiguiente se representa las siguiente cantidades de sustancias o componentes de un MS:

Substancia	Peso (en gramos)
NH4NO3	16,5
KNO3	19,0
CaCl2·2H2O	4,4
MgSO4·7H2O	3,7
KH2PO4	1,7

 

Para finalizar, bastará con verter el contenido en una probeta de 1 l, enrasar con agua destilada, trasladar la solución a su recipiente definitivo y agitarlo dejándolo reposar para su mejor concentración de la solución. Esta solución debe guardarse a 4 ºC en el refrigerador.

Preparación de una solución stock de micronutrientes MS x 100 (solución 2)

Para obtener un litro de dicha solución llenar un erlenmeyer de 1 l con 500 ml de agua destilada. A continuación añadir cada uno de sus componentes (Tabla 2) disolviéndolo totalmente antes de añadir el siguiente.

Substancia	Peso (en mg)
MnSO4·4H2O	2.230,0
ZnSO4·7H2O	860,0
H3BO3	620,0
KI	83,0
Na2MoO4·2H2O	25,0
CuSO4·5H2O	2,5
CoCl2·6H2O	2,5

 

Para terminar, proceder del mismo modo que con la solución stock de macronutrientes. Esta solución también debe almacenarse a 4 ºC.

 

2. 1. 6. PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

La preparación de los medios de cultivos permiten que se pueda hacer la propagación de plantas in vitro debido a que este le proporciona los componentes necesarios los cuales fortalecen el desarrollo de dichas plantas; un medio de cultivo es una formulación o preparado químicamente definida la cual proporciona los nutrientes necesarios para que una las condiciones favorables para el desarrollo de la misma; donde los explantes de plantas se puedan adaptar al el medio.

2.2. ESTERILIZACIÓN

2.2.1 generalidades

2.22.DEFINICION

 

Son una serie de métodos físico-químico, que sirven para eliminar los microorganismos y esporas de la superficie de instrumentos y medios de cultivos.

También se le conoce como proceso de esterilización por medio del cual un material, superficie o sitio se libera de cualquier microorganismo o espora. Una vez ocurrido dicho proceso de determina a dicho sitio, material o superficie estéril o esterilizada. Los microbios se eliminan, inhiben o matan por medio de agentes físicos o agentes químicos, otros incluyen los agentes mecánicos.

Los métodos de esterilización comprenden entonces, todos los procedimientos físicos, mecánicos y químicos que se emplean para destruir gérmenes patógenos.

Los más utilizados en la actualidad son los métodos físicos (calor, radiaciones, filtración, centrifugación) y los métodos químicos (agente químico).

2.2.1 TIPOS DE ESTERILIZACIÓN

			Ebullición
			tyndalizacion
		Calor húmedo	Pasteurización
			vapor a presión (autoclave)
			Flameado
		Calor seco	Incineración
	Físicos		Horno Pasteur (Aire caliente)
			Radiaciones Ionizantes
		radiaciones	Rayos gamma
			Rayos x
Métodos de Esterilización			Rayos ultravioleta
		Mecánicos	Filtración
			Sedimentación
	Químicos	gases	Oxido de etileno
			Otros

 

 

2.2.4.FACTORES QUE INTERVIENENEN EL PROCESO DEESTERILIZACION

 

 

Como es bien conocido, el éxito en el logro de esterilidad en cualquier preparación depende de muchos factores, como son la naturaleza de la sustancia que se esteriliza, el volumen contenido en cada unidad, el tamaño del recipiente y el número de unidades que se puedan manejar en una sola operación. Por consiguiente, no se pueden dar instrucciones especificas relacionadas con el método de esterilización que se utiliza para una preparación individual; en contraposición, se presentan sugerencias generales relacionadas con los procedimientos de esterilización.En los métodos físicos de esterilización encontramos que la Mufla los factores que intervienen son el tiempo y la T°, en la Filtración son el tamaño y en el Calor Húmedo son el tiempo, T° y presión.

 

La eficacia de un proceso de esterilización depende de cómo se realice el proceso en sí y de múltiples factores relacionados con el objeto: estructura física, nivel de contaminación inicial, de limpieza, compatibilidad con el proceso de esterilización, tipo de envoltorio, etc. Todas las fases de un proceso de esterilización (limpieza, preparación del equipo, esterilización, almacenaje y transporte) deben validarse y controlarse.

 

Factores relacionados con el objeto

El proceso de esterilización supone un reto importante para el material con luces o conductos largos o con espacios muertos. Para estos instrumentos será necesaria la aplicación de prácticas específicas.

Agua

Es importante verificar la calidad del agua para conseguir la máxima eficacia del detergente. Un agua dura puede disminuir su efectividad. Para evitar la corrosión del instrumental quirúrgico se recomienda la utilización de agua desmineralizada durante el proceso de limpieza o, como mínimo, en el último aclarado.

 

El detergente

Los detergentes neutros (pH 7) están indicados para la limpieza de instrumental quirúrgico delicado, pero son menos eficaces para la eliminación de sustancias orgánicas.

 

2.2.5 ESTERILIZACION CON CALOR HUMEDO

 

El calor húmedo destruye los microorganismos por coagulación de sus proteínas celulares. El principal método de esterilización que emplea calor húmedo es la esterilización por vapor a presión. Existen otros métodos de descontaminación que emplean este tipo de calor los cuales, aunque no permiten la destrucción total de los microorganismos, disminuyen la carga microbiana que posee un material.

El calor húmedo es la forma de vapor saturado a presión es eficaz parala destrucción de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es causada por la desnaturalización y coagulación de su proteína o su sistema intercelular enzima-proteína. Estas reacciones son catolizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos:

Calor húmedo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos como lagelatina, leche, etc. no soportan temperaturas elevadas y se realiza mediante los siguiente procedimientos:

Tindalización: hace uso del calor húmedo, para una buena esterilización se deberealizar a 100ºC por ½ hora (por tres veces discontinuas) durante 1 día.

Ebullición: es el paso de un líquido al estado de vapor. El agua en ebullición representaen forma eficaz y práctica de proporcionar una desinfección de alto nivel deinstrumentos y guantes que entren en contacto de las membranas mucosas, si bien alhervirlos por 20 minutos se aniquilan todas las formas vegetativas de las bacterias, losvirus, las levaduras y los hongos, pero no destruye a las esporas.

Pasteurización: elimina a todos los microorganismos no esporulados se puede variar lastemperaturas por ejemplo: 62ºC por 30 min.; 70ºC por 15 min. Se utiliza para preservar alimentos como ser leche, cerveza.

 

Entre estos métodos podemos citar:

• Tindalización (esterilización fraccionada)

• Agua hirviendo

• Pasteurización

• Olla de presión

 

Esterilización por vapor a presión

La esterilización por vapor a presión se lleva a cabo en un autoclave. Estos equipos emplean vapor de agua saturado, a una presión de 15 libras lo que permite que la cámara alcance una temperatura de 121ºC. El tiempo de esterilización usualmente es de 15 minutos, sin embargo, en algunas oportunidades, dadas las características del material, es necesario variar el tiempo de esterilización. Cuando se utiliza este método es importante controlar en el autoclave la relación entre la temperatura, la presión y el tiempo de exposición, ya que éstos son factores críticos en el proceso. Sólo cuando el vapor se coloca bajo presión, es cuando su temperatura aumenta por encima de los 100ºC y esto permite alcanzar las temperaturas de esterilización (121ºC).

 

Entre las ventajas de este método de esterilización tenemos que no deja residuos, los autoclaves modernos son sencillos de manejar y es un método rápido de esterilización. Éste es el método de elección para esterilizar materiales termoestables y no sensibles a la humedad como medios de cultivo, cultivos de microorganismos para descartar, lencería, uniformes, instrumentos quirúrgicos, etc. Esta forma de esterilización es segura y económica, no deja residuos tóxicos, es rápida,es cómoda, ya que los autoclaves son automáticos.

Entre sus desventajas están que no permite la esterilización de materiales sensibles al calor y materiales no miscibles con el agua como es el caso de polvos, aceites y grasas. Corroe los materiales metálicos, estropea los cortes, deteriora los materiales de goma o plástico, requiere mucho tiempo para la preparación de paquetes, bultos y también requiere mucho cuidado en la carga del autoclave.

 

Materiales que pueden esterilizarse por calor húmedo:

Textiles secos: (ropas, vestidos, paños, gasas, algodones).

Materiales duros: (envases, bateas, contenedores, etc).

Materiales que no pueden esterilizarse por calor húmedo:

Todos los que contengan sustancias grasas (gasas furanizadas,). (materiales termo sensibles como gomas y plásticos).

 

2.2.6ESTERILIZACIÓN DE MATERIAL DE CRISTALERÍA Y OTROS MATERIALES

 

 

Calor Húmedo

El calor húmedo produce desnaturalización y coagulación de proteínas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones:
El agua es una especie química muy reactiva y muchas estructuras biológicas son producidas por reacciones que eliminan agua.

AUTOCLAVE
Se realiza la esterilización por el vapor de agua a presión. El modelo más usado es el de Chamberland.
Esteriliza a 120º a una atmósfera de presión (estas condiciones pueden variar) y se deja el material durante 20 a 30 minutos.

Equipo
Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metálica, que en la parte inferior recibe calor por combustión de gas o por una resistencia eléctrica.

La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones, mariposas o charnelas. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manómetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete (también llamado espita) y el tercero, para una válvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte.

Tiempos de esterilización en autoclave

Del tiempo, temperatura y presión usadas en la esterilización depende el éxito alcanzado. Generalmente los datos presión y temperatura son fijados, y el único factor que se varía es el tiempo. Los materiales necesitan diferentes tiempos de esterilización dependiendo de su textura, porosidad, y otras características propias de cada material. Algunos materiales como el hule, necesitan poco tiempo, mientras otros como el metal quirúrgico necesitan más. 2.2.7 esterilización de medios de cultivos

ESTERILIDAD DEL MEDIO Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estériles para evitar la aparición de formas de vida que puedan alterar, enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clásico para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza vapor de agua a presión como agente esterilizante)

2.2.7 ESTERILIZACION DE MEDIOS DE CULTIVOS

1. • Es el proceso mediante el cual se alcanza la muerte de todas las formas de vida microbianas, incluyendo bacterias y sus formas esporuladas altamente resistentes, hongos y sus esporos, y virus. Se entiende por muerte, la pérdida irreversible de la capacidad reproductiva del microorganismo.

2. • Los agentes que matan microbios son denominados microbiocidas (cida= “matar”) o más comúnmente denominados “germicidas”. Si el agente específicamente destruye bacterias, es llamado bacteriocida; si mata hongos es denominado fungicida. Como sea después de exponer el objeto esterilizado al aire o a sus alrededores, éste otra vez se habrá contaminado con microorganismos

2.3.- ESTABLECIMIENTO EL CULTIVO DE TEJIDOS

2.3.1.- ETAPAS DEL CULTIVO DE TEJIDOS

Etapa (0) Establecimiento de plantas donadoras de explantes

Etapa (1) Introducción asepsia (in vitro)

Atapa (2) Multiplicación

 

Atapa (3) Enraizamiento

 

Etapa (4) Adaptación al clima

 

ETAPA (0) ESTABLECIMIENTO DE PLANTAS DONADORAS DE EXPLANTES

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

 

ETAPA (1) INTRODUCCIÓN ASEPSIA (IN VITRO)

 

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

 

Una vez elegida la planta madre, se extraerán los fragmentos a partir de los cuales se obtendrán los explantes. Los explantes pueden ser yemas, trozos de hojas, porciones de raíces, semillas, etc. Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los contaminantes más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Una vez desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal. Estos explantes se introducirán en un tubo de cultivo conteniendo medio de iniciación para poder controlar la sanidad y la viabilidad, luego de realizar la desinfección del material con hipoclorito de sodio (agua clorada comercial), pura o diluída durante un período de 5 a 15 minutos, seguido por 3 a 4 enjuagues en agua esterilizada.

 

ATAPA (2) MULTIPLICACIÓN

 

Durante esta fase se espera que los explantes que sobrevivieron la FASE 1 y 2 originen brotes (de procedencia axilar o adventicia) con varias hojas. En la base de cada hoja hay una yema que se desarrollará luego de ser puesta en contacto con el medio de cultivo. Periódicamente estos nuevos brotes se deben subcultivar en un nuevo medio mediante divisiones y resiembras en tubos de cultivo u otros recipientes adecuados. Estas operaciones se realizan en la cámara de flujo laminar o en un lugar aislado que nos permita mantener las condiciones de asepsia. De esta forma aumenta el número de plantas en cada repique o división de las plantas.

 

El número de plantas que se obtiene dependerá de la especie vegetal y de las condiciones del medio de cultivo. El número de plantas que se obtiene por la vía de la micro propagación permite alcanzar incrementos exponenciales, considerando que todos los factores que afectan el crecimiento hayan sido optimizados.

 

ATAPA (3) ENRAIZAMIENTO

 

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un

 

tamaño aproximado de 2 centímetros. Los brotes obtenidos durante la fase de

 

multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.

 

ETAPA (4) ADAPTACIÓN AL CLIMA

 

Manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso depende de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta

2.3.1.1 ESTABLECIMIENTO ASÉPTICO

 

Establecimiento, que consiste en la desinfección de los explantos (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático según se desee.

El cultivo de tejidos comienza a partir de trozos extraídos de la planta madre. Estos pequeños órganos o trozos de tejido se llaman explantos. Las plantas que crecen en el medio natural están contaminadas por microorganismos (bacterias y hongos). Los explantos antes de ser introducidos en el medio de cultivo han de ser esterilizados. Posteriormente se introducirán en el medio a su vez estéril y se mantendrán allí en condiciones asépticas.

2.3.1.2 MULTIPLICACIÓN

 

Multiplicación, para generar una masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.

Se excluirán no sólo las partes que presenten lesiones, aunque sean ligeras, pues las mismas podrían ser de naturaleza parasitaria o infecciosa, sino también los órganos de apariencia sana pertenecientes a plantas afectadas por enfermedades criptográmicas o virosas susceptibles de existir ya en el interior de las células y de manifestarse en un periodo relativamente corto.
Una vez que la primera fase se ha completado con éxito, comienza la multiplicación de los explantos. El explanto encuentra en el medio de cultivo todo aquello que necesita para su crecimiento y desarrollo (agua, elementos minerales, azúcares, hormonas, etc). Tras un período de crecimiento (4-8 semanas) es necesario el subcultivo y paso a un nuevo medio. Es en este paso donde se produce la multiplicación de las plantas.

2.3.1.4 ADAPTACIÓN

 

Adaptación o Rusticación, que es la aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones ambientales ex vitro (suelo o algún sustrato inerte)

Proceso fisiológico o rasgo morfológico o del comportamiento de características que incrementan la supervivencia y/o el éxito reproductivo

La adaptación es un proceso normalmente muy lento, que tiene lugar durante cientos de generaciones y que en general no es reversible.

Esta fase consiste en el paso de las plantas del cultivo al medio natural. Este es un paso extremadamente importante, ya que si no se realiza cuidadosamente se pueden perder gran número de plantas.

2.3.2.- SELECCIÓN DE PLANTAS MADRES

Para poder establecer el cultivo en condiciones de asepsia, se deben obtener explantes con un nivel nutricional y un grado de desarrollo adecuado. Para obtener estos explantes es recomendable mantener a las plantas madre, es decir la planta donadora de yemas, durante un período de tiempo que puede oscilar entre unas semanas o varios meses en un invernadero bajo condiciones controladas. En ese ambiente se cultiva la planta en condiciones sanitarias óptimas y con un control de la nutrición y riego adecuados para permitir un crecimiento vigoroso y libre de enfermedades.

2.3.2.1 GENOTIPO

El genotipo es la totalidad de la información genética que posee un organismo en particular, en forma de ADN. Junto con la variación ambiental que influye sobre el individuo, codifica su fenotipo. De otro modo, el genotipo puede definirse como el conjunto de genes de un organismo y el fenotipo como el conjunto de rasgos de un organismo. Por tanto, los científicos y los médicos hablan a veces por ejemplo del genotipo de un cáncer particular, separando así la enfermedad del enfermo. Aunque pueden cambiar los codones para distintos aminoácidos por una mutación aleatoria (cambiando la secuencia que codifica un gen, eso no altera necesariamente el fenotipo). Se le llama genotipo a toda la dotación genética. Hay 23 pares de cromosomas en la especie humana, en total 46. La ordenación recibe el nombre de cariotipo.

2.3.2.2 FITOSANIDAD

 

La contaminación microbiana es uno de los problemas más graves en la micropropagación de especies vegetales a nivel mundial, produce cuantiosas pérdidas de material, tanto en los trabajos de investigación como en la micropropagación comercial. Puede tener dos orígenes: a) microorganismos que colonizan la superficie o el interior del explante (endófitos) y b) microorganismos introducidos durante la manipulación en el laboratorio. Los contaminantes más frecuentes en condiciones in vitro son los hongos, las bacterias y levaduras, denominados "vitropatógenos", aunque también existen otros menos frecuentes como los virus, viroides y microartrópodos (ácaros y trips). El término vitropatógeno ha sido usado para aquellos organismos que no son necesariamente patógenos para las plantas en el campo, pero sí son perjudiciales para células, tejidos u órganos cultivados in vitro, mientras que el término patógeno ha sido confinado para describir a un organismo que causa enfermedad a las plantas cultivadas en el campo.

 

 

 

 

 

 

2.3.1.3 ENRAIZAMIENTO

 

Antes de llevar las nuevas plantas al exterior es necesario proporcionarles una raíz con la que sean capaces de realizar sus actividades vitales una vez que se encuentren de nuevo en el medio natural. La inducción de estas raíces se produce modificando ligeramente las características del medio de cultivo adecuándolas para la generación de raíces.

 

Enraizamiento, en la que se busca la formación de raíces con el fin de convertir los brotes o embriones somáticos en plántulas completas.

Antes de extraer los explantes se hará una desinfección de los fragmentos de planta madre para eliminar los contaminantes externos. Los más comunes son los hongos y las bacterias que habitan en forma natural en el ambiente. Desinfectado el material vegetal, se debe mantener en condiciones de asepsia. A efectos de obtener las condiciones de asepsia, se trabajará en cabinas de flujo laminar para extraer los explantes a partir del material vegetal.

 

2.3.2.3 EDAD DE LA PLANTA

 

Gran parte del éxito de cultivo de tejidos, esta en la edad del explante que va a ser utilizado para los trabajos. La edad de la planta y el grado de diferenciación del tejido, muchas veces son están interrelacionados, y pueden producir efectos interactivos cundo se cultiva in vitro.

 

. Así también la producción de yemas adventicias en explantes de hojas de Cucumis melo, mostraron mayor producción en los explantes que tenian un a tamaño entre 0.3 y 0.5mm los cuales tenían 14 días de plantados. Esta propiedad no tenían aquellos explantes que tenían mas de 21 días.

La edad del explante pude clasificarse en cuatro clases:

 

<!--[if !supportLists]-->« <!--[endif]-->Edad del órgano o de la planta desde que ha sido extraída: Es la edad biológica de la planta, es el tiempo que ha transcurrido desde que la planta comenzó como retoño o como embrión.

 

 

Los tejidos juveniles presentan una mayor capacidad morfogenetica, la cual se manifiesta en respuesta de crecimiento, proliferación y enraizamiento, a diferencia de un tejido maduro el cual es más difícil de desdiferenciar e inducir a la producción de raíces y brotes.

 

Órganos jóvenes o bien rejuvenecidos son los que tienen mejor respuesta en el establecimiento que los obtenidos a partir de materiales adultos. El empleo de explantes que se encuentran expuestos a bajos niveles de patógenos puede resolver el problema de la contaminación por hongos y bacterias durante el establecimiento del cultivo in vitro.

 

2.3.2.4 CONDICIONES DE CRECIMIENTO DE LA PLANTA

 

Las plantas no son capaces de mantener su temperatura constante por lo que los cambios de temperatura ambiental influyen sobre su crecimiento y desarrollo, son poiquilotermas, pero esto no significa que su temperatura sea igual que la del ambiente, pueden haber diferencias. Lo que sí es cierto es que las variaciones de temperatura ambiental originan variaciones en la temperatura de la planta. Las variaciones de la temperatura ambiental son periódicas, diarias (día/noche) y estacionales, también se dan variaciones fluctuantes +/- previsibles como la variación de temperatura por nubosidad, variaciones dependientes de la posición de la hoja en la planta, las hojas tapadas por otras hojas tendrán menos temperatura, también depende de la velocidad del viento, altura de la hoja así como la forma de hoja. Además, la temperatura de la raíz no tiene porque ser igual a la temperatura de la parte aérea ya que las variaciones de temperatura llegan a la raíz con retardo respecto a las de la parte aérea. El régimen térmico dentro del vegetal es complejo ya que se dan variaciones de temperatura en las diferentes plantas. En el campo no se pueden realizar estudios y en el laboratorio es complicado reproducir las condiciones ambientales, por lo que no hay buenos estudios. Los diferentes procesos fisiológicos tienen diferentes temperaturas óptimas y tambien especies diferentes tienen diferentes temperaturas óptimas. Normalmente, para un proceso utilizamos:

temperatura óptima.

temperatura cardinal.

temperatura crítica.

 

2.3.2.5 EDAD DEL ÓRGANO O TEJIDO VEGETAL

 

Edad del órgano de la planta desde que ha sido extraída de su medio: edad biológica de la planta tiempo que ha transcurrido desde que la planta comenzó como retoño.

 

2.3.3.- EXPLANTE

El concepto de explante se refiere a cualquier parte vegetal que ha sido separada de la planta, que puede ser un tejido (fragmentos de hojas, tallos, raíces, pétalos, etc.), un órgano (semillas, anteras, ovarios, botones florales, hojas y raíces completas, etc.), estructuras como las anteras y los ovarios, o bien células individuales (como en el caso de los protoplastos3). Con excepción de los óvulos y el polen, los explantes están constituidos por tejidos y/o células somáticos.

El nombre “explante4” es una versión castellanizada del vocablo inglés “explante”; acuñado especialmente para identificar a los tejidos vegetales cultivados in vitro y sin otro significado. La selección del explante es un aspecto clave para tener éxito en el cultivo de tejidos, ya que dependiendo de su ubicación en la planta, del tipo de tejido que contiene, de su edad cronológica y fisiológica, de su contenido endógeno de hormonas, entre otros, se comportará de una manera o de otra.

2.3.3.1 TIPO DE EXPLANTE

Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, células sueltas, protoplastos, esporas, granos de polen o semillas (Fossard 1999). El tipo de explante a usarse en los procesos de micropropagación depende de la especie con la que se esté trabajando y de los objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son genéticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir múltiples clones de una forma o variedad con características especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros explantes como las yemas adventicias son mas bien genéticamente inestables y producen un alto grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es útil para la producción de plántulas con una determinada característica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante esta variación semi–natural, es posible obtener nuevas líneas de cultivo.
Una vez que se ha obtenido el explante, este debe ser correctamente desinfectado para evitar la proliferación de contaminantes biológicos (bacterias, hongos y levaduras principalmente) en el medio, los cuales afectan el crecimiento y desarrollo cámara de crecimiento con condiciones de humedad, temperatura y fotoperiodo controladas para su desarrollo.

 

2.3.3.2 POSICIÓN DEL EXPLANTE EN LA PLANTA

 

Los explantes se colocaron en cajas Petri de 12 x 100 mm con 20 mL de medio de cultivo esterilizado. Se aplicaron seis tratamientos a cada genotipo, resultado de la combinación de los dos tipos de explantes y los tres medios de cultivo. Cada tratamiento tuvo quince repeticiones, y un explante representó una repetición. Los explantes se incubaron en oscuridad total a 26 °C y 50 % de humedad relativa.
Las variables de respuesta para este experimento fueron: porcentaje de explantes con capacidad de respuesta morfogénica, expresada en crecimiento de los bordes del explante; porcentaje de explantes con callogénesis; y porcentaje de explantes con callo embriogénico, esta última detectada con base en la presencia de embriones en diferentes estados de desarrollo (fase globular, acorazonado, torpedo y cotiledonar), en una muestra de 0.83 g de callo. La evaluación de las variables se llevó a cabo a los 60 d del establecimiento in vitro.

2.3.3.3 TAMAÑO DEL EXPLANTE

 

Entre más grande sea el explante mayores serán las posibilidades de inducir la proliferación de callos o la regeneración directa de órganos. Sin embargo, a mayor tamaño de explante también son mayores las probabilidades de que los cultivos sean contaminados con microorganismos

2.3.4. SIEMBRA DEL EXPLANTE

Luego de la desinfección superficial, las semillas o las yemas (explante) dependiendo del material seleccionado, se ponen en medio de cultivo estéril. Esto se realiza haciendo uso de una pinza esteril para evitar toda contaminación por microorganismos: hongos, bacterias, virus, esporas.

En un período de una semana o quince días, comienza el proceso de germinación o regeneración de nuevos tejidos vegetales, iniciando el ciclo de cultivo in vitro.

Es importante conservar la polaridad de la planta madre. Segmentos de tallos y yemas deben ser colocados en el medio con la polaridad adecuada.

 

2.3.4.1 DESINFECCIÓN DEL EXPLANTE

 

Realizar una adecuada preparación de la planta dadora de explantes, cultivándola preferentemente en invernaderos tratadas con productos químicos que eliminen patógenos y eventuales microorganismos endófitos.

Los explantos deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo. Protocolo del tipo de esterilización superficial de material vegetal son:

 

- Lavado con agua corriente durante 20-30min

- Etanol 70%, entre 5 y 10 seg.

- Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) de 5 a 20%, entre 5 y 30 min. Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2 ), entre el 0,01 y 0,05%.

- Enjuagues con abundante H2O estéril (4 ó 5 veces).

- En el caso del HgCl2 , el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.

Lavado inicial con detergente para eliminar las partículas e impurezasmás grandes, seguido de una inmersión en alcohol de 95º; posteriormente unadesinfección inicial con NaOCl más fuerte que la segunda (también en NaOCl), y 3lavados con agua destilada estéril después de cada desinfección con NaOCl paraeliminar los restos de los compuestos químicos.

2.3.4.2 DISECCIÓN DEL EXPLANTE

 

Cultivar los explantes en una cámara de transferencia con aire estéril («gabinete de flujo laminar»), localizada en un ambiente limpio y no expuesta a corrientes de aire. De no disponer este equipamiento, se pueden sustituir con cuartos esterilizados previamente con luz ultravioleta (nunca exponerse a la luz UV en forma directa). La mesada de trabajo y las paredes del gabinete deben ser desinfectadas previamente con etanol al 70%. De la misma manera deben ser desinfectados exteriormente todos los recipientes (conteniendo medios de cultivo, agua, etc.) que ingresen en el área del aire estéril. Los operarios constituyen frecuentemente una importante fuente primaria de contaminación, porque es recomendable que, antes de comenzar a trabajar laven sus manos y antebrazos con abundante agua y jabón y se des infecten con etanol al 70 %. La utilización de guardapolvos, guantes y máscaras protectoras de la boca y de la nariz, así como los gorros protectores de los cabellos, ayudan a reducir sensiblemente los niveles de contaminación. Los instrumentos de trabajo (pinzas, pipetas, tijeras, agujas, cápsulas de Petri) deben ser esterilizados antes de su uso. Muchos de estos instrumentos pueden ser colocados en etanol al 95% y, antes de ser usados, se deben flamear cuidadosamente en la llama de un mechero.

2.3.4.3 SIEMBRA DE DIFERENTES MEDIOS: SÓLIDOS Y LÍQUIDOS

 

Consistencia del medio.

El metabolismo de los tejidos puede modificarse dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). dependiendo de las características del medio de cultivo (líquido o semi-sólido). En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad del ágar pueden tener importantes efectos en el desarrollo del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.). El cultivo en medio líquido se utiliza cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías. El cultivo en medio líquido se utiliza cuando la propagación in vitro es desarrollada a través de las siguientes vías:

 

- Inducción de embriogénesis

- Cultivo de protoplastos

- Cultivo de suspensiones celulares

Otro aspecto importante a tener en cuenta es la consistencia del medio de cultivo. Puede emplearse como semisólido o líquido. El agente gelificante más empleado en el cultivo in vitro es el agar extraído de diversas algas marinas. Las diferentes calidades existentes en el mercado modifican la expresión morfogénica debido a que pueden contener sustancias inhibitorias o promotoras del crecimiento. Tal es el caso del cultivo de hojas de Actinidia chinensis, cultivadas en una solución de MS con el agregado de 0,1 mg.L -1 de AIA + 1 mg.L -1 de BAP, donde se observó una respuesta morfogénica diversa según el tipo de agar seleccionado. Por ejemplo, cuando el gelificante empleado fue Chubut-agar, de producción nacional, se observó una gran diferenciación de yemas adventicias, mientras que con el agregado de agar SIGMA R sólo se indujo la proliferación de callo.

 

2.3.5.- CONDICIONES DE INCUBACIÓN

 

La incubación de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Porlo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperiodo, humedad atmosférica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cámaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (frío-calor), una buena y uniforme circulación de aire en el interior, dotados de un buen sistema de alarma para interrumpir la iluminación en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 ºC, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8 horas. La luz es generalmente provista por lámparas fluorescentes del tipo «luz día» con unairradiancia de entre 50 y 200µmol.m-2.s-1 .La humedad atmosférica debe ser elevada (80-90%).

 

Durante el período de incubación, los cultivos son expuestos a condiciones ambientales disímiles al ambiente externo. La atmósfera interna se caracteriza por presentar una considerable variación diurna en la concentración de CO₂, humedad relativa elevada, temperatura constante e intensidad lumínica baja. A su vez, el medio de cultivo compuesto por concentraciones elevadas de azúcares (en aquellos sistemas heterótrofos y semiautótrofos de micropropagación), sales y reguladores del crecimiento, sumado a la ausencia de microorganismos, generan anormalidades morfológicas, anatómicas y fisiológicas que las plantas deberán corregir cuando son transferidas al ambiente externo.

2.3.5.1 FOTOPERIODO

 

La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO. Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, La alternancia de los ciclos de luz con los de oscuridad: EL FOTOPERÍODO. Algunos fenómenos propios del desarrollo de las plantas (germinación, floración, tuberización,...) pueden ser activados por el número de horas diarias de luz que recibe la planta. De forma análoga, el número de horas de luz que recibe el explanto cultivado in vitro puede afectar a su desarrollo. En general, el mejor fotoperiodo in vivo será también el mejor fotoperiodo in vitro.

2.3.6.- CAMBIOS FISIOLÓGICOS DEL EXPLANTE

No realiza fotosíntesis.

 

Crecimiento en condiciones controladas.

 

Crecimiento en condiciones de asepsia.

 

Alta humedad relativa.

 

Estomas no funcionales ya que no cierran y por lo tanto el agua se escapa.

 

Ausencia de pelos radiculares tienen raices delgadas que solamente son funcionales en el frasco.

 

Ausencia de cera en la cutícula.

2.3.7.- TRASPLANTE AL SUSTRATO

ELECCIÓN DE UN MEDIO DE ENRAIZAMIENTO DE LOS EXPLANTES

Para enraizar los explantes se utilizan principalmente plantines individuales de un tamaño aproximado de 2 cm. Los brotes obtenidos durante la fase de multiplicación se transfieren a un medio libre de reguladores de crecimiento o que solo contenga hormonas del tipo de las auxinas. Algunas especies de plantas no necesitan pasar por esta etapa y emiten sus raíces en el mismo medio de cultivo donde desarrollan yemas nuevas, por lo tanto el proceso de multiplicación y enraizamiento transcurren en forma simultánea.

ACLIMATACIÓN DE LOS EXPLANTES ENRAIZADOS

Los explantes recién enraizados son muy sensibles a los cambios ambientales, de manera que el éxito o el fracaso de todo el proceso dependen de la aclimatación. En esta etapa las plantas sufrirán cambios de diferente tipo que permitirán la adaptación de las mismas a vivir en condiciones naturales. En el momento en que se extraen los explantes o plantines enraizados de los frascos, están poco adaptados a crecer en un invernáculo, ya que estos explantes han enraizado y crecido en ambientes con una humedad relativa muy elevada y generalmente tienen estomas (estructuras responsables de regular la transpiración y pérdida de agua en la planta) que no son completamente funcionales frente a descensos de la humedad relativa, y por lo tanto demasiado lentos para evitar la desecación del explante. Por otra parte, crecer en ambientes tan húmedos también suele implicar la falta de una cutícula con cera bien desarrollada, que representa la barrera física para evitar la perdida de agua a lo largo de toda la superficie de la planta. Los plantines enraizados, deben ser aclimatados a las condiciones de humedad del invernadero disminuyendo progresivamente la humedad relativa e incrementando progresivamente la intensidad de luz. Estos plantines se plantarán en contenedores (almacigueras) cubiertos por un plástico, para mantener la humedad relativa elevada. La elección de un sustrato con buenas características físicas, es clave para el éxito de esta etapa. Para el trasplante, elegimos un sustrato suelto, poroso, con mezcla de arena turba, cáscara de arroz quemado, para permitir un desarrollo y crecimiento de raíces muy rápido. Las mezclas son diferentes y muy variadas de acuerdo a la especie con la que estamos trabajando. Luego de retirar cuidadosamente el agar de las raíces para evitar dañarlas, los plantines se enjuagan y se colocan en almacigueras con la mezcla de sustratos seleccionada y cubiertos con nylon. Todos los días se debe controlar el nivel de humedad en las almacigueras. Si es necesario, se aplica un riego con una pulverizadora manual, para mantener un ambiente húmedo a nivel del sustrato. A los 15 días del trasplante, se puede comenzar a levantar la cobertura de nylon en las horas de menor calor (temprano en la mañana o en la última hora de la tarde). Al comienzo las plantas se dejan media hora por día destapadas. A la semana siguiente se dejan destapadas durante una hora. Al mes del trasplante, se dejan tapadas durante la noche y si hay crecimiento de nuevas hojas, las plantas pueden permanecer destapadas. Las condiciones del cultivo in vitro, generan cambios en algunos aspectos anatómicos y fisiológicos de las plantas, por esta causa, durante la aclimatación, los cambios deben ser muy graduales, para minimizar el estrés y tener mayor tasa de sobrevivencia.