TAREA : CULTIVO DE ANTERAS Y OVULOS
CULTIVO DE ANTERAS
El cultivo de anteras (CA)es una técnica por medio de la cual es
posible producir líneas homocigotas a partir de poblaciones
segregantes,mediante el doblamiento cromosómico del polen haploide y la
regeneración de plantas en un ciclo de cultivo invitro.En contraste por los
métodos estándar de fitomejoramiento normalmente se requieren seis generaciones
de autofecundación para alcanzar la completa homocigosis en palntas autogamas.
DESARROLLO DEL CULTIVO DE ANTERAS
Se desarrolla en dos etapas principales :
* Inducción de microcallos
* Regeneración de plantaas
INDUCCION DE MICROCALLOS
En una primera face del C.A. se induce la formación de microcallos colocando las anteras en un medio cuya composición estimule selectivamente la división mitótica de las microspóras , a expensas de las células somaticas en el filamento, el tejido conectivo y la pared de la antera .El medio para inducir esa formación debe tener altas concentraciones de auxinas
El arroz, el estado de polen optimo para esa inducción es el comprendido entre el unicleado tardio y binucleado temprano .
A los 20 dias de cultivo se forma una masa diferenciada de tejido llamada microcallo, el cual contiene mas de 100 celulas por cada microspora involucrada en el proceso . el microcallo alcanza un tamaño de 2 mm alrededor de los 30 o 50 dias
Las anteras (órgano floral de
las fanerógamas; se halla en la porción final de los estambres y contiene el polen en unas cavidades denominadas sacos polínicos.)
contienen células sexuales masculinas haploides, el polen,
los cuales cultivadas en un medio apropiado, pueden regenerar plantas también haploides. Aún cuando durante la evolución pudieron surgir especies haploides
solamente entre organismos inferiores, puede ser conveniente durante varias
etapas del proceso de mejora disponer de plantas haploides. Estas plantas,
también llamadas haplontes, pueden ser obtenidas en diferentes especies,
directamente a partir de las células del polen.
Ventajas de
los haploides
- Pueden manifestarse fenotípicamente alelos recesivos que en este estado no pueden ser encubiertos por los alelos dominantes, por esta razón las plantas haploides pueden constituir un material útil para realizar estudios genéticos y mutagénicos.
- Cuando son diploidizados, se obtienen individuos totalmente homocigóticos, eso brinda la posibilidad de la obtención de plantas homocigóticas en una sola generación, a diferencia de los métodos tradicionales de autofecundación o selección, que requieren mucho tiempo para ello y aún así es imposible alcanzar la homocigosis total.
- Constituyen un material que no induce poliploidía en experimentos de hibridación somática (fusión de protoplastos).
Las dos primeras posibilidades
son aprovechadas en la mejora práctica a partir de 1964,
donde se desarrolló por primera vez embriones directamente a partir de anteras,
sin la intervención del proceso de fecundación. Desde entonces el número de especies
en las que se ha podido obtener haploides mediante el cultivo de anteras se ha
ampliado a unas 200. Es posible la obtención de haploides a partir de gametos
femeninos en los ovarios, pero como el número
de los gametos masculinos en las anteras es considerablemente mayor, se
prefieren las anteras como material básico para la obtención de haploides.
Fines de los
haploides diploidizado
- La producción de líneas estrictamente homocigóticas.
- La reducción considerable del proceso de obtención de dichas líneas.
- La utilización de los individuos diploidizados como progenitores en programas de cruzamiento.
El más amplio empleo de los
haploides lo constituye hasta el momento la obtención de líneas homocigóticas.
Los híbridos heterocigóticos de la primera generación filial resultantes del
cruzamiento de determinados progenitores segregan posteriormente en formas
homocigóticas de forma espontánea en el caso de las plantas autógamas. Para el mejorador no es
posible, aún en el caso de coeficientes de multiplicación muy altos, la
obtención de poblaciones de más de un millón de individuos dentro de una
generación, por lo cual se hace necesario racionalizar la vía para lograr una
conveniente homocigotización para la creación de líneas altamente
homocigóticas, como es el caso de la utilización de la haploidía. Con mucha menor
frecuencia son utilizados hasta el momento los haploides para la obtención y
selección de mutantes.
Fuentes
Cultivo de óvulos
El cultivo de óvulos es una
técnica que se ha empleado tradicionalmente para evitar barreras de
incompatibilidad que dificultan algunos cruces inter e intraespecíficos, para
eludir problemas de abscisión prematura del fruto, para la obtención de
híbridos que presentan aborto del embrión en estadios tempranos del desarrollo,
como vía alternativa a la androgénesis en la obtención de plantas haploides o
como sistema experimental para el estudio de la respuesta in vitro de
zigotos y proembriones.
Los primeros intentos de aislar óvulos fecundados y cultivarlos en condiciones asépticas fueron llevados a cabo por White en 1932 con Antirrhinum majus; sin embargo, la técnica fue desarrollada y perfeccionada en el Departamento de Botánica de la Universidad de Delhi. Ya en 1960 Kanta desarrolló con éxito una técnica de polinización directa del ovario. Para ello, aisló un ovario inmaduro lo cultivó in vitro, lo perforó e introdujo en la cavidad ovarica polen sin germinar. Posteriormente, siguiendo en esta línea, Kanta et al. (1962) intentaron llevar a cabo otras aproximaciones aislando directamente óvulos inmaduros para después polinizarlos in vitro y cultivarlos hasta la obtención de embriones maduros. Esta técnica, denominada test de fertilización o polinización ovular in vitro, se realizó por primera vez en Papaver somniferum y desde entonces ha sido aplicada satisfactoriamente a otras muchas especies.
El cultivo de óvulos es un procedimiento complejo aconsejable sólo en los casos en los que sea estrictamente necesario, ya que el porcentaje de éxito es muy bajo y la manipulación del material es difícil. Esto se debe a que el óvulo es una estructura muy pequeña y delicada que requiere microcirugía para su aislamiento, resultando relativamente fácil dañarla. Además, al tratarse de un tejido altamente hidratado, no debe sufrir desecación durante su manipulación, que debe ser rápida y llevarse a cabo bajo una lupa estereoscópica provista de una fuente de luz fría. Es importante recordar que el aislamiento de los óvulos y del polen (en el caso de llevarse a cabo una polinización in vitro) debe hacerse en el estado fisiológico y morfológico correcto ya que de otra forma el proceso no tendría lugar. Por ello, debe hacerse un estudio de la duración de los distintos estadios del desarrollo de los órganos a aislar para saber cuándo se encuentran en el estadio adecuado para su cultivo.
El óvulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, algunos no muy claros, que varían con el estadio del desarrollo del mismo y que es necesario poner a punto para cada especie a tratar. Hay que tener en cuenta que el medio no sólo debe ser satisfactorio para el desarrollo del óvulo sino también para otros procesos que como la germinación del polen, son necesarios para la fecundación y desarrollo del embrión. Todo ello complica aún más los requerimientos nutricionales y hace que se busquen, en la medida de lo posible, vías alternativas al cultivo de óvulos aislados.
A la hora de llevar a cabo la polinización in vitro, el polen se deposita sobre los óvulos en una gota de medio que permita su germinación o, en los casos en los que el polen sea incapaz de germinar bien sobre el óvulo, se hace germinar primero y luego se añade. Son varios los medios que se emplean para la germinación de los granos de polen, pero todos ellos tienen como componentes fundamentales una elevada concentración de sacarosa y la presencia de ácido bórico. En condiciones normales, el polen germina en pocas horas, y 1-2 días después de la polinización tiene lugar la fecundación de los óvulos.
Algunas alternativas al cultivo de óvulos, en algunos casos válidas, son las siguientes :
Los primeros intentos de aislar óvulos fecundados y cultivarlos en condiciones asépticas fueron llevados a cabo por White en 1932 con Antirrhinum majus; sin embargo, la técnica fue desarrollada y perfeccionada en el Departamento de Botánica de la Universidad de Delhi. Ya en 1960 Kanta desarrolló con éxito una técnica de polinización directa del ovario. Para ello, aisló un ovario inmaduro lo cultivó in vitro, lo perforó e introdujo en la cavidad ovarica polen sin germinar. Posteriormente, siguiendo en esta línea, Kanta et al. (1962) intentaron llevar a cabo otras aproximaciones aislando directamente óvulos inmaduros para después polinizarlos in vitro y cultivarlos hasta la obtención de embriones maduros. Esta técnica, denominada test de fertilización o polinización ovular in vitro, se realizó por primera vez en Papaver somniferum y desde entonces ha sido aplicada satisfactoriamente a otras muchas especies.
El cultivo de óvulos es un procedimiento complejo aconsejable sólo en los casos en los que sea estrictamente necesario, ya que el porcentaje de éxito es muy bajo y la manipulación del material es difícil. Esto se debe a que el óvulo es una estructura muy pequeña y delicada que requiere microcirugía para su aislamiento, resultando relativamente fácil dañarla. Además, al tratarse de un tejido altamente hidratado, no debe sufrir desecación durante su manipulación, que debe ser rápida y llevarse a cabo bajo una lupa estereoscópica provista de una fuente de luz fría. Es importante recordar que el aislamiento de los óvulos y del polen (en el caso de llevarse a cabo una polinización in vitro) debe hacerse en el estado fisiológico y morfológico correcto ya que de otra forma el proceso no tendría lugar. Por ello, debe hacerse un estudio de la duración de los distintos estadios del desarrollo de los órganos a aislar para saber cuándo se encuentran en el estadio adecuado para su cultivo.
El óvulo presenta una gran cantidad de requerimientos nutricionales, algunos no muy claros, que varían con el estadio del desarrollo del mismo y que es necesario poner a punto para cada especie a tratar. Hay que tener en cuenta que el medio no sólo debe ser satisfactorio para el desarrollo del óvulo sino también para otros procesos que como la germinación del polen, son necesarios para la fecundación y desarrollo del embrión. Todo ello complica aún más los requerimientos nutricionales y hace que se busquen, en la medida de lo posible, vías alternativas al cultivo de óvulos aislados.
A la hora de llevar a cabo la polinización in vitro, el polen se deposita sobre los óvulos en una gota de medio que permita su germinación o, en los casos en los que el polen sea incapaz de germinar bien sobre el óvulo, se hace germinar primero y luego se añade. Son varios los medios que se emplean para la germinación de los granos de polen, pero todos ellos tienen como componentes fundamentales una elevada concentración de sacarosa y la presencia de ácido bórico. En condiciones normales, el polen germina en pocas horas, y 1-2 días después de la polinización tiene lugar la fecundación de los óvulos.
Algunas alternativas al cultivo de óvulos, en algunos casos válidas, son las siguientes :
- Polinización estigmática in vitro: Esta técnica consiste en el cultivo del pistilo y polinización in vitro del estigma. Este tipo de fertilización no requiere ninguna manipulación especial, salvo si es necesario la emasculación del botón floral, por lo que es una de las más sencillas de llevar a cabo. Se realiza satisfactoriamente en los casos de caída prematura del fruto.
- Polinización placentaria in vitro: En este método se aislan los óvulos con un trozo de placenta, para lo que se divide el ovario en dos o más mitades de forma que los óvulos queden expuestos. De esta forma, se simplifican tanto el medio nutritivo como las manipulación necesaria para el aislamiento de los óvulos, sufriendo éstos muchos menos daños físicos así como un menor choque hídrico, por lo que el porcentaje de supervivencia se ve incrementado. Esta técnica se puede emplear para evitar barreras de incompatibilidad localizadas en el estigma y/o estilo, así como para la obtención de plantas haploides.
En
el caso de plantas que sufren aborto de embriones en estadios tempranos del
desarrollo y en aquellos cruces en los que la barrera de incompatibilidad se
encuentra a nivel del ovario, es necesario rescatar los óvulos recién
fecundados o incluso fecundarlos in vitro.
Actualmente, el cultivo de óvulos aislados o con tejido placentario se está empleando cada vez más en la mejora genética de plantas (Hormaza y Herrero, 1996), no sólo porque permite cruces casi imposibles de obtener en la naturaleza, sino porque además permite seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estrés (térmico, salino, etc.), acelerando así la obtención de plantas resistentes (Zamir y Gadish, 1987; Sacher et al., 1983).
Actualmente, el cultivo de óvulos aislados o con tejido placentario se está empleando cada vez más en la mejora genética de plantas (Hormaza y Herrero, 1996), no sólo porque permite cruces casi imposibles de obtener en la naturaleza, sino porque además permite seleccionar para la fecundación aquellos granos de polen que hayan sido capaces de germinar bajo condiciones de estrés (térmico, salino, etc.), acelerando así la obtención de plantas resistentes (Zamir y Gadish, 1987; Sacher et al., 1983).
Eva
Domínguez Carmona es becaria F.P.I. (C.S.I.C.). Carlos López Encina es
Colaborador Científico del C.S.I.C., Estación Experimental La Mayora (Málaga).
jose luis soto apolinar
M buena información
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