2.1 MEDIOS DE CULTIVO
2.1.1 AREAS DEL LABORATORIO
DE CULTIVO DE TEJIDOS
Se pueden distinguir 3 areas importantes:
CAMARA DE FLUJO LAMINAR:
Es llamada así por que contiene en su interior un Cabina de Flujo
Laminar; es el área mas estéril del Laboratorio, todo lo que ingrese en esta
área debe estar debidamente esterilizado (material de vidrio, agua destilada),
y el personal deberá entrar con el equipo necesario, es decir, con guantes,
tapones para oídos, forro para pies, Mandil limpio y mascarilla quirúrgica.
Esta área deberá ser limpiada después de realizar cualquier
trabajo en su interior, para asegurar su condición aséptica.
Esta zona debe estar completamente aislada de las otras, se debe
evitar que entre el polvo o los insectos.
Contenido:
- Repisas
de Vidrio de varios pisos
- Lamparas
de tubo fluorescente.
- Frascos
Sembrados.
- Termometro
Es el área donde se colocara el explante después de la siembra, y donde
además se desarrollara durante todas fases del programa. El explante, será
colocado sobre repisas de vidrio, con iluminación artificial. Las
luces deberán encenderse al empezar el día de trabajo y se apagaran al
finalizar la jornada de trabajo. La limpieza es esencial, cuando un frasco se
contamina en alguna parte del proceso, el mismo es retirado de la repisa y
llevado un lugar despejado para ser eliminado.
Contenido:
- Balanza
analitica
- refrigeradora
- Autoclave
- Lavaplatos
- Cocina
Anaqueles de almacenamiento(para frascos, instrumentos, reactivos y
papeleria).
Es un área de transito abierto, en este lugar se recibe, procesa
y desinfecta todo (sustrato, medio de cultivo, material), para que entre
asépticamente a las cámaras.
2.1.1.1
AREAS DE PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO Y ESTERILIZACION
Los
medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de
sus constituyentes
básicos, o por simple rehidratación de productos asequibles comercialmente
(medios
de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de
los
medios de cultivo deshidratados porque, además de simplificar el trabajo, con
ellos se
tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles.
Para su
preparación se deben tener en cuenta los siguientes aspectos:
• Prepararlos
sólo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores
que
suministren productos de calidad.
• Utilizar
agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiológica y fisicoquímica
adecuada.
• Utilizar
materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o
desmineralizada.
• Controlar
el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilización. Nunca
se deben
exceder las condiciones señaladas por el fabricante.
Los medios de cultivo
deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo
las condiciones que
señale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar
fresco (entre 15 y 25°),
con poca humedad y protegidos de la luz solar directa. Nunca
se deben almacenar
cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor.
Los medios de cultivo
deshidratados son higroscópicos. Cuando los envases de estos
medios de cultivo
deshidratados son abiertos para su uso inicial, se debe tener la
precaución de
cerrarlos tan pronto como sea posible y mantenerlos bien cerrados
para prevenir la
entrada de humedad. La absorción de agua produce cambios de pH,
formación de grumos,
decoloraciones del polvo, etc., lo cual indica que deben ser
descartados porque
pueden haber sufrido cambios químicos o estar contaminados.
Una vez que el medio
de cultivo ha sido preparado y esterilizado, puede almacenarse
a temperatura
ambiente por un periodo máximo de 2 semanas protegido de la luz, o
por periodos mayores
a 12 -15ºC. Sin embargo, almacenados bajo refrigeración entre
2 y 8°C se prolonga
la vida útil de los mismos, (nunca por debajo de 0ºC porque se
destruye la
estructura del gel). Los medios de cultivo se deben mantener en recipientes
bien cerrados para
evitar su deshidratación y cuando se usa tapón de algodón, se
debe colocar por
encima una envoltura de papel (Craft).
Otro punto importante
a tomar en cuenta, es que cada lote de medio de cultivo preparado
debe pasar por un
riguroso proceso de control de calidad, en donde se determinan
sus propiedades
fisicoquímicas (apariencia, pH, etc.) y microbiológicas (esterilidad
y promoción de
crecimiento) verificando que cumplan con los requisitos de
calidad establecidos
y por ende demostrar que son aptos para su uso.
En esta área se realizan el trabajo de excisión, inoculación y
transferencia de los explante a los medios de cultivo. Este trabajo demanda los
más altos niveles de limpieza ambiental, se recomienda la instalación de
gabinetes de flujo horizontal o vertical de aire filtrado o bajo presión o la
construcción de cuartos de transferencia. Sin embargo, ciertas operaciones de
inoculación como la excisión y el cultivo de ápices y meristemas en tubos de
ensayo de boca angosta, se pueden realizar sobre una mesa limpia, ubicada en un
lugar del laboratorio libre de corrientes de aire y de polvo. Los gabinetes de
flujo laminar deben ubicarse en lo posible en un lugar alejado de las puertas y
con un mínimo de corriente de aire, con el fin de prolongar la vida útil de los
filtros.
Área física de 2.4 X 3.6 metros
Aislada con pocas corrientes de aire, alejado de puertas.
Superficies lavables y de fácil desinfección.
Mesones.
Estantería.
Mechero.
Estereoscopio.
Equipo de disección.
2.1.1.4. AREA DE INCUBACION
En esta área es donde permanecen los medios sembrados con explantes para
su desarrollo y crecimiento. El área de incubación debe proporcionar un buen
control de la temperatura (20-28ºC) , la iluminación, la cual puede ser
variable y la humedad relativa. El área de estar libre de agentes contaminantes
para que no intervengan en el crecimiento del cultivo. En esta área se debe
controlar la temperatura, para lo cual se puede hacer uso de aparatos de aire
acondicionado, para evitar el recalentamiento.
Área de cuarto de crecimiento
Área física de 5.4 X 3.6 metros.
Aislado a temperaturas entre 24 a 29ºC.
Humedad relativa entre 70 a 80%.
16 horas luz por 8
horas de oscuridad
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